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(详细翻阅法医 DNA 分型第六章) 减少 stutter 产

时间:2019-08-10 11:25 作者:admin1

  STR 常见问题、原因及解决方法讨论整理 stutter 产物 1、 什么是 stutter 产物? stutter 产物又被称为影子带,或者 DNA 聚合酶滑脱产物。(复制链错配假说)PCR 产物比主要 扩增产物少一个重复单位。 2、 产生机制 DNA 复制过程中的滑动,或 DNA 复制和修复时滑动链与互补链碱基错配,导致一个或几个 重复单位的缺失或插入造成。 DNA 复制过程中,因为子带链的插入或模板链的脱落导致的引物一模板复合物的一个区域在引物 延伸的过程中发生错配,此时引物或者模板滑脱导致一个重复单位形成碱基非配对环。 (a)在复制过程中重复区域 DNA 双链很容易彼此解开。由于每个重复单位相同,在双链重新复性时可能会不按照配 对顺序,从而发生一个重复单位的错位。(b)如果在延伸过程中新合成链凸出一个重复单位,则会在下一轮复制过程 中增加一个重复单位形成插入。(c)反过来讲,如果在模板链凸出一个重复单位,则新合成的链就比全长 STR 等位 基因短一个重复单位。这种情况发生的频率与侧翼序列、重复单位及待扩增等位基因的长度有关。总的来说,四核苷 酸 STR 基因座 stutter 产物出现频率小于 15%,在分型图谱中表现为一个比 STR 等位基因短一个重复单位的小峰。 3、 表现状态 1、通常比相应的主要等位基因小一个重复单位,或多一个重复单位 2、一般小于相应等位基因峰高的 15%。 3、stutter 的量取决于基因座、PCR 条件以及所用的聚合酶。 4、随重复单位的增长 stutter 产物有减少的倾向。 (五核苷酸重复<四核苷酸重复<三核苷酸重复<二核苷酸重复) 5、在一个基因座内较大等位基因的 stutter 产物量更多。 6、序列重复不完全时,stutter 产物量减少。(详细翻阅法医 DNA 分型第六章) 减少 stutter 产物的方法: 1、应用重复单位较长的 STR 标记(四、五碱基重复); 2、含有不完全重复单位的 STR 等位基因(TH01 9.3); 3、选用扩增活性强的 DNA 聚合酶(如 C-Taq 酶); 4、优化扩增条件。 补充:为什么一个基因座 Pannel 下出现 3 个扩增峰? CSF1PO ① 样本本身即为三带 三带 ② 其他荧 光引起的 Pull-up 峰 ③ 两个等位基因的 Stutter 峰恰好重叠,导致 Stutter 峰叠加偏高 二、非模板添加(+A 不全或-A 峰) 1、 产生机制 DNA 聚合酶在复制模板链时在 PCR 产物的 3`末端添加一个额外的腺苷酸(+A),故 PCR 产物 比实际靶序列长一个碱基,而当酶在 DNA 复制过程中没有在所有复制链上添加腺苷酸,则产生-A 峰。 2、表现状态 3、解决方法 1) 在非标记引物 5’端添加特殊“尾巴” ( e.g., G or GTTCTT )详细翻阅法医 DNA 分型第六章 2) 提高终延伸温度(1℃左右)或增加终延伸时间(e.g., 15-45 min at 60 or 72 ℃) 3) 调整模板 DNA 浓度至最适宜范围(e.g., 0.5~2.0ng),一般为降低模板浓度 4) 换用高质量的 Taq 酶(e.g., AGCU C-Taq 热启动酶) 三、微变异 1、定义 含有某种序列变异的等位基因被称为微变异,因为它们与完全重复的等位基因仅有细微的差别。 例 TH01:9.3 的重复区包括 9 个完全重复单位(AATG)和一个三核苷酸的不完全重复的时候,丢 失了一个碱基。等位基因 9.3 和 10 的区别是在第七个重复单位有一个腺嘌呤碱基的缺失。 AATG—AATG—AATG—……AATG—AATG— AATG—AATG—AATG 6次 第 7 次丢失 2、确认微变异 1)先确定该 OL 峰并非扩增或电泳引起的杂峰 2)使用其他试剂盒重新验证 3)有条件可以做测序验证 4)与已报道过的微变异进行比较并记录在案 补充:稀有等位基因 1、稀有等位基因的相关概念: ① 稀有等位基因与常见的等位基因相差一个或一个以上的碱基 ② STR 等位基因的序列变异可以是插入,缺失或者核苷酸改变 ③ 与常见等位基因比较,含有某种序列变异的等位基因称为微变异,因为它们与完全重复的等位基 因仅有细微的差别。在 STR 遗传标记中常见的微变异的例子是 THO1 9.3 ④ 三带会出现两种情况 4.1 三个峰带型在强度上基本相同 4.2 三个峰带型在强度上出现不均衡现象 (这种特殊的峰并不是混合物的产物,而是样本的复制假象) 2、常见稀有基因: D13S317 Bin 外 D7S820 9.1 9.3 10.1 11.1 12.1 Penta.E 17.4 18.4 19.4 20.4 21.4 Bin 外 D6S1043 12.3 17.3 18.2 19.3 20.3 22.3 Bin 外 D21S11 30.1 30.3 FG A 因引物设计问题,Bin 进入 D5( ABI / Promega ) CSF 因引物设计问题,Bin 进入 D19(与 FGA 情况一致) 知识点分享: 1、bet36体育投注VWA 出现 14 号等位基因时,如果是杂合子则易出现不均衡现象(14 号较高)。 2、PE 出现 5 号等位基因时,如果是杂合子且两峰相离较远时则易出现不均衡。 四、拔起峰(Pull up) 1、 拔起峰从何而来 Matrix 文件通过包含每种颜色的样本的电泳而建立,各种颜色的电泳结果组合成一种数学矩阵,以 消除与其他颜色光谱重叠的部分,每一种荧光染料都有不同波长的最大发射光谱,而当某一荧光染料过 多造成 matrix 去颜色叠加不能正常工作,会发生“拔起”(Pull up)的现象。拔起是由于颜色从一个光 谱通道扩散到另一个的结果,通常由于超高峰的原因。详细翻阅法医 DNA 分型第 13 章 2、 表现状态 3、 原因及解决方法 引起的原因 DNA 模板量过多 扩增循环数过多 上样量过多 多种电泳问题 减少的方法 重新扩增减少模板 DNA 加样 量 重新扩增减少扩增循环数 电泳检测时减少 PCR 产物加 样量 电泳检测时减少进样时间或 电压 重建光谱校正 维护仪器,跟换毛细管、激光 管、CCD 补充:何为 Matrix ? Matrix 的作用是什么? 一:Matrix(ABI 3100 中称为光谱校准)为电泳时不同颜色的分离标准。如果不能确定峰的颜色, 则不能正确判读此样本的基因分型。Matrix 在稳定的环境条件下是相当精确的。 二:每种荧光染料都有不同波长的最大发射光谱,被用来分离各种颜色的滤光片显示在四种染料光 谱中央。在滤光片波长范围内可明显观察到这几种染料的重叠。FAM 和 HEX 之间的重叠程度尤其高。 这种重叠影响到发生在两种染料检测通道间易引起 Pull- up。 五、 无效等位基因 如果 DNA 模板的 PCR 引物结合区发生单碱基突变,就会阻碍引物的结合,导致扩增失 败,称为无效等位基因。 六、 出峰延迟及出峰提前 DNA 模板的正向引物结合区,发生碱基突变 出峰提前 出峰延迟的原因 解决的方法 电泳迁移率变慢 出峰延迟 出峰提前的原因 解决的方法 电泳迁移率变快 Buffer 长时间不换, 缓冲能力变差 胶过期或室温放置 时间过长 及时更换 Buffer 保 证 胶 的 质 量 , Pop 胶放置在仪器上不要 超过 1 周 Buffer 长时间不换, 缓冲能力变差 胶过期或室温放置时 间过长,Pop 胶的类 型与仪器不匹配,如 及时更换 Buffer 保 证 胶 的 质 量 , Pop 胶放置在仪器上不要 超过 1 周 Oven 温度过低 室内环境温度过低 设定 Oven 温度为 60 摄氏度 控制环境温度 在 22 摄氏度左右 Pop-7 Oven 温度过高 室内环境温度过高 设定 Oven 温度为 60 摄氏度 控制环境温度 在 22 摄氏度左右 七、 变性不全(二级结构) 1、定义 变性过程中温度升到一定高度,双链分开,形成单链。温度快速下降保持单链状态,(eg.95℃ ~ -20℃)如果慢慢降温,单链则开始重新配对,配对过程中发生错配因而导致二级结构。 2、表现形态 3、解决方法 1)样品电泳前进行变性处理:95 ℃加热 3 min,立即冰浴 3min 2)使用高质量的去离子甲酰胺,-20℃分装保存;勿使用过期变质的胶 八、 电泳基线 电泳基线即为电泳自身发射出的线谱。(机器稳定性的判别点) 非正常电泳基线、 电泳基线不平原因:主要原因是电泳系统中存在荧光物质干扰 2、电泳基线)及时更换水和 Buffer 2)Water Wash 冲洗 Block(胶块) 3)更换胶、更换毛细管 4)养成良好的仪器维护习惯,保持电泳系统干净 九、 数据分析时出现 Off Ladder 峰 现象 原因 解决方法 a. 所有基因座均为 OL a. 电泳时未加 Ladder 或分析时忘记 a. 加 Ladder 重新电泳;分析时改回 峰 选择 Sample Type 或 Ladder 中内标 “Ladder”重新分析 迁移率与样品中内标迁移率差别过 大 b. 小 片 段 基 因 座 正 b. 内标定义不完全 b. 手动更改设置,将后面的 siz 添上 常,大片段基因座出现 去 OL 峰 c. 个别基因座出现 OL 峰 c. Ladder 电泳质量差;干扰峰影响 Ladder 正常分型 c. 删除不好的 Ladder 或重新电泳 (如果是拔起峰干扰,降低上样量或 减少进样时间和进样电压后重新电 泳) d. 正常的 OL 峰 d. 微变异 d. 通过与 Ladder 或相应的 siz 值计 算其峰值 十、 峰型前高后低 1、查看 SIZ,确认是电泳问题 原因 ? Buffer 长时间不换,缓冲能力变差 ? 胶块或连接管中有气泡 ? 毛细管堵塞 ? 毛 细 管 使 用 次 数 过 多 ( 3730 600runs ) 解决办法 ? 及时跟换阴、阳极 Buffer ? 每天都应检查胶块或连接管中有无气泡, 及时排除 ? Fill Array(填充)数次、空跑甲酰胺或去 离子水 ? 更换毛细管 (周末或节假日关机前,用去离子水或甲酰胺电 泳 1~2run,以清洗毛细管中残留的杂质,延长 毛细管使用寿命。) 1、 不是电泳问题,是样本问题 原因 ? PCR 抑制物太多 ? DNA 降解 十一、检测峰太强和检测峰太弱 2、 检测峰太强 解决方法 ? 纯化模板 检测峰过强会导致 Pull up 峰 前高后低 无法正确分型或分型错 误 个别基因座扩增不平衡 3、 检测峰太弱 原因 模板量过多 扩增循环数过多 加样量过多 进样量过多 解决方法 调整模板量至最适范围 减少扩增循环数 减少加样量、进样时间或 /和进样电压 实验版: 原因 模板量浓度过低 扩增循环数过少 加样量过少 进样量过少 PCR 抑制物过多 DNA 降解 解决方法 调整模板量至最适范围 增加扩增循环数 增加加样量、进样时间或 /和进样电压 纯化模板 专家版: 原因 解决方法 模板 DNA 不纯 重新纯化 模板 DNA 量不足 增加模板用量 模板 DNA 量太多 减少模板用量 酶活性不足 换用高质量的 Taq 酶 扩增程序不正确 查看并选择正确的扩增程序 高盐浓度或 pH 改变 样本中过多的钾、钠、镁离子或 EDTA 可影 响 PCR 热循环仪或 PCR 管有问题 引物浓度太低 毛细电泳进样差 选择高质量高规格的仪器和耗材 用推荐的体系进行扩增 换用新的毛细管 补充:打孔时如何控制模板量? ① 新鲜血样:较浅血样,挑选颜色较深且双面均有血斑处打孔。 较深血样,挑选单面血斑处打孔,如正反面均有血斑,则在血斑与滤纸间打孔(血斑 占滤纸的 2/3 左右) ② 1~2 年血样,挑选双面血斑处打孔。 ③ 陈旧血样,挑选颜色较深且双面均有血斑处打孔,如扩增效果不佳,则选用 1% Triton X-100 浸 泡 10min ~ 30min,烘干。 血红素较多(近期采集的血样),抑制 PCR 反应如何处理? ① 将血滤纸片用扩增仪或烘箱烘 95℃ 15~30min,其作用是将新鲜血样变为陈旧血样,效果得到明 显改善。 ② 水洗(此方法不常用,改善效果不明显) 十二、荧光脱落 标记在引物上的荧光素与引物间的链接断裂,荧光素残基聚集形成大分子聚合物,电泳检测时则表 现为某一种颜色中在一个固定的位置出现了一个不是扩增产物的峰。 FAM:123-127bp;HEX:170bp 1、 表现状态 2、 形成原因(理解版) 1) 引物未优化:荧光素引物未能完全匹配结合,但又未经优化,若有多余的荧光素,形成荧光脱落 2) 在 DNA 复制过程中,荧光素一小部分与引物脱离,形成荧光脱落。(很多脱落的小荧光素会聚集在 一起,电泳检测时形成明显的荧光脱落) 十三、补充知识点 1、迁移率 AL 迁移率与样本内标迁移率有区别的原因: 当电泳环境不稳定或不佳时, AL 内标迁移率与样本内标迁移率有区别。 2、—A 峰为什么要在非标记引物 5”端添加尾巴“G或“GTTCTT” 促使聚合酶在所有模板链上都能加“A” 3、样本中 VWA 有非特异性峰 14# 因为在引物设计时,并未在模板库比对。所以当扩增条件不稳定时,引物并不在特定区域延伸复制, 而选取 DNA 中其他区域另一匹配位置复制延伸,造成非特异性峰。 4、引物设计 1)设计引物长度一般为 18-30bp,如果太短,更容易在 DNA 模板其他区域匹配复制,易形成非特异 性峰。如果太长,虽然可避免非特异峰,但不容易复制,要升高退火温度。 2)设计引物一般选取特定模板区两边的保守区。 3)标记引物,在引物 5”端添加荧光素 5、D13 与 THO1 竞争严重该如何处理?(D13 高,TH01 低) 退火温度上调 1- 2℃( 一般情况下只上调 1℃ ) 6、DNA 的三种形态: ① 线状:松弛线性的 L 构型(中) ② 环状:松弛开环的 OC 构型(慢) ③ 螺旋状:超螺旋的 SC 构型(快)